Несмотря на стремительное развитие фармацевтических компаний и широкий спектр лекарственных средств на рынке, одним из главных критериев успешного лечения пациента является положительный индивидуальный фармакологический ответ организма на назначенный препарат. Фармакогенетический тест позволяет прогнозировать этот ответ у конкретного человека в зависимости от его генотипа, выбрать персонализированную стратегию лечения и в конечном итоге подобрать безопасную и в то же время эффективную дозировку лекарства или их набора. Для прохождения генетического теста человеку сперва необходимо сдать биоматериал для анализа в лаборатории. Мы в Genotek анализируем кровь или слюну. Затем происходит расшифровка ДНК и биоинформатическая интерпретация с использованием специальных алгоритмов и баз данных. По результатам фармакогенетического теста человек получает отчет, на основании которого врач может корректировать лечение.
Прогресс в научно-технических разработках и возросший интерес к фармакогенетике за последние 3 года привели к увеличению количества проводимых генетических тестов и руководств на их основе.
По текущим данным PharmGKB (https://www.pharmgkb.org) аннотировано 679 лекарственных веществ, существует 139 клинических рекомендаций по дозировке, основанных на результатах фармакогенетического тестирования, и включена информация по фармакогенетике в аннотации к 369 лекарственным вещества.
Разные лаборатории применяют различные технологии для расшифровки генома, анализируют разные наборы генетических вариантов, по-разному интерпретируют результаты. В 2019 году международной организацией European Molecular Quality Network (EMQN, https://www.emqn.org) была предложена программа аудита качества фармакогенетических тестов для разных лабораторий.
Что такое EMQN?
European Molecular Quality Network (EMQN) является некоммерческой организацией, расположенной в Великобритании, которая проводит независимый аудит качества генетического тестирования в лабораториях. Наличие сертификата EMQN, подтверждающего успешное прохождения аудита, является одним из показателей качества результатов теста. Genotek не первый раз принимает участие в испытаниях EMQN: в прошлом году EMQN присвоил нам наивысший балл за качество секвенирования (NGS). В этом году организаторы запустили пилотный проект по оценке качества проведения фармакогенетического тестирования, где мы также решили принять участие.
Как проходит испытание?
В испытуемую лабораторию организаторы (EMQN) отправляют образцы ДНК и сопутствующее описания (направление врача на проведение фармакогенетического теста). На выполнение задания и отправки отчета дается около 2,5 месяцев. Каждая лаборатория вправе сама выбирать технологию анализа биоматериала, способы интерпретации и так далее. Сообщать результаты фармакогенетического тестирования предлагается в соответствии с принятым в тестируемой лаборатории стандартами, следуя рекомендациям из Kalman et al., 2016. PDF-отчеты для каждого образца отправляются на проверку. Спустя некоторое время организаторы публикую истинные генотипы для тестируемых образцов, статистику по участникам испытания, используемым технологиям, результатам. Каждой лаборатории присылается сертификат с указанием количества набранных баллов и комментариями.
Задания.
К нам в лабораторию поступило 3 образца ДНК пациентов и брошюра с описанием заданий и рекомендациями по оформлению отчетов. В частности, заранее был ограничен список генов, которые следует исследовать: CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A5, DPYD, F5, HLA-B, SLCO1B1, TPMT, UGT1A1 и VKORC1. Например, задание для одного из образцов формулировалось следующим образом: “Женщина 55 лет с раком молочной железы. Лечащий врач просит провести фармакогенетическое тестирование перед назначением терапии с помощью тамоксифена”. Для каждого из случаев требовалось интерпретировать полученные генотипы, важные для конкретного случая (лекарства). Дополнительно для второго случая необходимо было предоставить клиническую интерпретацию результатов. Информационный лист по каждому из образцов содержал: номер пробирки, имя, фамилию, пол, дату рождения и возраст, анамнез (заболевание, жалобы на побочные эффекты от назначенного препарата) и наименование лекарства, которое хочет назначить лечащий врач. В описании также содержалась информация об объеме предоставляемого образца, методе выделения ДНК, оценке чистоты и концентрации ДНК в образце.
Прохождение испытания.
Все три образца успешно прошли лабораторный контроль качества. Генотипирование проводилось на микрочипах Illumina Infinium Global Screening Array v2.0 (GSA v2.0). Суммарно исследовалось порядка 240 генетических вариантов для указанных генов. Для определения генотипов и копийности генов использовалось программное обеспечение Genome Studio, а также собственные скрипты на языках R и Python. Интерпретация генетических вариантов была основана на фармакогенетических базах данных и рекомендациях таких, как PharmGKB, CPIC (Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium), FDA и других.
При выполнении заданий нам потребовалось решить ряд нетривиальных задач.
- Определение числа копий (CNV, copy number variation). В общем случае поиск CNV с помощью микрочипов высокой плотности не всегда показывает хорошие результаты. Однако, последние версии микрочипов (в частности, GSA v2.0) смоделированы таким образом, чтобы эффективно определять наличие некоторых известных CNV. Например, GSA v2.0 использует дополнительные зонды в гене CYP2D6, что позволяет детектировать его делецию/дупликации. Так в случае первого пациента гаплотип *10 был обнаружен в двух копиях (*10×2), который обладает понижающей функцией.
- Определение списка генетических вариантов для интерпретации. PharmGKB содержит информацию о большом количестве генетических вариантов с разным уровнем доказательности. Мы, в первую очередь, ориентировались на генетические маркеры с высоким уровнем доказательности (Level 1A/B) или имеющих рекомендации CPIC (guidelines).
- Отсутствие некоторых генотипов. Поскольку микрочипы (в отличие от полногеномного секвенирования) исследуют не все позиции в геноме, а приблизительно 650 000 генетических маркеров, некоторые генотипы (например, требующиеся для определения гаплотипов цитохромов) могут отсутствовать. В отчетах в разделе об ограничении метода мы четко указывали, какие генетические варианты были исследованы. В частности, для цитохрома CYP2D6 мы указали, что не можем эффективно различить гаплотипы *4 и *10, поскольку на нашем микрочипе отсутствовал маркер rs3892097, отличающий их друг от друга.
- Возможность использования дополнительной генетической информации. В некоторых случаях бывает полезной информация о популяционной принадлежности исследуемого (для определения более часто встречаемого гаплотипа или при составлении заключения). Благодаря использованию технологии микрочипового генотипирования, мы смогли определить, что пациент из первого случая являлся представителем афро-американской расы. Кроме того, для составления клинического заключения во втором случае полезно было уточнить, является ли пациент представителем африканской расы.
Результаты.
В общем заключении EMQN описываются ошибки и статистика по всем лабораториям-участникам. Всего в данном пилотном тестировании участвовало 30 лабораторий из 15 стран. Из них 26 прислали отчеты, 1 отозвала отчет и 3 не прислали отчет. Genotek была единственным участником из России. Треть лабораторий использовали более одного лабораторного метода. Наиболее популярными методами были секвенирование по Сэнгеру и ПЦР в реальном времени.
Результаты каждой лаборатории оценивались по трем показателям: качество генотипирования, верность интерпретации результатов и правильность оформления отчета (отображение информации о пациенте). За каждый показатель максимально можно было получить 2 балла. Существует перечень ошибок (не известный заранее участникам испытания), за которые снижались баллы. Например, при оценке генотипирования снижалась итоговая оценка на 0,5 балла за неправильную зиготность, а также за ошибку в номенклатуре; 0,25 балла – за использование некорректной номенклатуры и т.д. При оценке интерпретации результатов за отсутствие или недостаточно информативное заключение, а также за рекомендации, представляющие опасность для пациента, снижали итоговую оценку на 1 балл; за отсутствие описания методики и указания ограничений/чувствительности снимали 0,5 и 0,25 балла, соответственно.
По результатам оценки работы лаборатории выставлялась обобщенная оценка — satisfactory за максимальные результаты и poor за минимальные.
За генотипирование нами был получен максимальный балл (2 из 2). При этом средний балл среди всех участников был равен 1.83. За интерпретацию нами был получен максимальный балл (2 из 2). При этом средний балл среди всех участников был равен 1.58. Итоговое заключение независимого аудита фармакогенетического теста Genotek – satisfactory.
Выводы и заключения.
Мы считаем, что подобная добровольная сертификация полезна для всех лабораторий, предоставляющих услуги генетического тестирования. Нам приятно, что итоговая оценка EMQN свидетельствует о высоком качестве лабораторных и биоинформатических анализов по фармакогенетике, проводимых в Genotek.
